Nitric oxide inhibits the replication cycle of severe acute respiratory syndrome coronavirus. - Abstract - Europe PMC

一酸化窒素は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの複製サイクルを阻害する



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要約


一酸化窒素(NO)は、いくつかのウイルス感染に対して阻害効果を有することが示されている細胞間の重要なシグナル伝達分子である。本研究の目的は、NOが重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS CoV)の複製サイクルをインビトロで阻害するかどうかを調べることであった。我々は、有機NOドナーであるS-ニトロソ-N-アセチルペニシラミンが、濃度依存的にSARS CoVの複製サイクルを有意に阻害することを発見した。また、NOがウイルスタンパク質およびRNA合成を阻害していることもここで示す。さらに、NOを産生する酵素である誘導性一酸化窒素合成酵素によってNOが生成され、SARS CoV複製サイクルが阻害されることを実証する。

新しいコロナウイルス(CoV)に関連する重症急性呼吸器症候群(SARS)は、2002年秋に中国の広東省(24、32、34)で初めて特定された。 SARSの死亡率は6~55%(12、20、21)の範囲に及ぶ。コロナウイルスは、約27〜30kb(21)のゲノムを有する一本鎖陽性感覚RNAウイルスを包み込む。コロナウイルスは、SARS CoVがコロナウイルス属内で明確なグループを形成するコロナビリダ科に属する(9, 29) 。

一酸化窒素(NO)は、細胞間の重要なシグナル伝達分子であり、広範囲のプロセス(9,27)に関与している。いくつかの細菌および原生動物およびいくつかのウイルス(1、18、27)に対するNOの抗菌活性が記載されている。NOは、l-アルギニンの酸化をNOおよびl-シトルリン(9)に触媒する3つの酵素によって産生される。2つの酵素は、神経一酸化窒素合成酵素(nNOS)および内皮NOS(eNOS)であり、カルシウム依存性と構成的に発現される(27)。誘導性NOS(iNOS)は、活性化細胞でのみ発現され、カルシウムに依存しない(11)。iNOSのアップレギュレーションは、感染時に一般的であり、一部のウイルスおよび細菌は、NO(1、2、11、26、30)の増加レベルによって阻害または刺激されることが知られている。 また、マウスマクロファージ、マウスT細胞、ヒト肝細胞、単核細胞、ヒト気道上皮細胞、および肺胞マクロファージ(6、13、15、25、31、33)におけるインターフェロン刺激後にiNOSが発現していることも実証されている

SARS CoV感染におけるNOの役割を調べるため、1の多重度感染性(MOI)でSARS CoVを用いたベロE6細胞を感染させた。1 h ポストプレゼント (hpi) で、細胞を 2 回洗浄し、有機 NO ドナー S-ニトロソ-N-アセチルペニシラミンの異なる濃度で治療または治療を模倣 (SNAP;シグマ、セントルイス、Mo.)または、負のコントロールとして、N-アセチルペニシラミン(NAP;シグマ)は、NO-寄付S-ニトロソグループ(3、7、18、19、27)を欠いている。 24hpiでは、ウイルスの量を50%組織培養感染投与(TCID50)によって推定し、これは採取されたウイルスの異なる希釈によって細胞培養中に誘導された細胞変性効果から算出した。図に示すように。図1A、1A、SNAPは用量依存的にSARS CoVの複製サイクルを阻害した。100 μM SNAPによる治療は、子孫ウイルスの収率を2対数で減少させ、400 μMスナップで阻害効果がさらに顕著になりました。図に示すように。図1B、1B、観察された阻害効果は、培養培地へのNO2の放出と相関し、Griess試薬(14、16、28)使用によって決定される。SNAPの検出された抗ウイルス効果が細胞に対する毒性から生じた可能性を排除するために、MTT細胞増殖試験(アメリカンタイプカルチャーコレクション)を実施した。これらの結果は、SNAPの抗ウイルス効果が一般的な細胞毒性によるものである可能性を明確に排除した(図。(図1C1C).

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NOはSARS CoV感染に抗ウイルス効果を有する。ベロE6細胞は1.0のMOIでSARS CoVに感染した。1hpiでは、細胞をSNAP(•)およびNAP(○)の異なる濃度で処理した。(A)ウイルスは24hpiで採取し、力素を決定した。(B)SNAPおよびNAPの異なる濃度で24時間の後処理で産生される亜硝酸塩濃度。(C)細胞生存率は、MTTアッセイによって決定される。2つの実験の平均値が示される。

VEro E6細胞におけるSARS CoV感染に対するNOの阻害効果は、前述のように免疫蛍光アッセイおよびウェスタンブロッティング(5)によって、SARS CoV NP(ルイス・マルティネス・ソブリドおよびアドルフォ・ガルシア・サストルが親切に提供)に対して向けられたウサギのポリクローナル抗体を用いてさらに実証された。この抗体は、細菌で発現したSARS CoVの精製組換えNP(L.マルティネス・ソブリド、個人的なコミュニケーション)に対して引き上げられた。ベロE6細胞は、1のMOIでSARS CoVに模擬感染または感染した。1 hpiでは、細胞をMOCK処理またはSNAPまたはNAP(400 μM)で処理した。12または24 hpiで、細胞を固定またはlysedし、その後分析した。結果は明らかに400 μMのSNAPによる処置が感染細胞の数を減らすことを示した(図。(図2A)2A)とNP発現の大幅な低下を実証した(図。(図2B2B).

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免疫蛍光アッセイおよびウェスタンブロット分析は、SNAPがSARS CoV複製サイクルを阻害することを明らかにした。ベロE6細胞は1.0のMOIでSARS CoVに感染し、1 hpiで400 μMのスナップまたはNAPで処理した。Vero E6細胞を24hpiで80%アセトンで固定し、免疫蛍光アッセイ(A)で分析し、12hpiでlysedし、ウェスタンブロッティング(B)で分析するか、250 μCiの放射線/mlで1時間パルスし、lysedし、次にドデシルスルフェートポリアクリミドゲル化(C)で分析した。


NP発現の減少がタンパク質翻訳の一般的な阻害によるものであった可能性を排除するために、我々は、セロE6細胞を模倣して処理したか、SNAPまたはNAP(400 μM)でそれらを処理した。24時間の後処理で、細胞を250μCiの放射線/mlで1時間パルスした。細胞を、先に述べたようにドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解し、分析した(22)。結果は、コントロール細胞のそれと比較してSNAP処理細胞におけるタンパク質翻訳の総量が減少していないことを明らかに示した(図。(Fig.2C2C).

NOがSARS CoVのウイルスRNA複製プロセスを阻害するかどうかを調べるには、0.1のMOIでSARS CoVを持つベロE6細胞を感染させた。1 hpiでは、細胞を400μMのSNAPまたはNAPで処理し、トリゾル(ギブコ/ライフテクノロジーズ/インビトロジェン、フローニンゲン、オランダ)を異なる時間に使用して、そして、合計RNAを分離しました(4)。ウイルスRNAは、後述するリアルタイムPCRにより後述する方法で定量した。ReSSQ SARSアッセイ(LightUpテクノロジーズAB、ストックホルム、スウェーデン)は、メーカーの指示に従ってLightCycler 1.0機器(ロシュ診断、バーゼル、スイス)でリアルタイムPCR定量に使用されました。ReSSQアッセイの対象遺伝子断片の1つは、定量化のためにこの標準を使用できるようにするために、ベルンハルト・ノヒト熱帯医学研究所(BNI)によって配布されたSARS標準で使用される断片とほぼ同一であるように設計されました。したがって、報告されたすべての定量はBNI標準に基づいています。図に示すように。図3、3を見て、ウイルスRNAの産生が400μMのSNAPによって有意に阻害されたことを実証した。

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SNAPはSARS CoVのウイルスRNA複製をブロックする。ベロE6細胞は、MOI 0.01で感染し、1hpiで400 μM SNAP(•)またはNAP(○)で処理した。処理された細胞は、異なる時間にトリゾールを使用してリセドされ、ウイルスRNAは、テキストに記載されるように定量化された。

細胞培養におけるSARS CoVの複製サイクルにおけるiNOSの効果を調べるため、我々は、セロE6細胞を模倣し、10ngの組換えヒトインターロイキン-1β(IL-1β)(1 U/ml)で治療した。ペプロテック、ロンドン、イングランド)/ml、組換えヒトガンマインターフェロン(IFN-γ)/mlの400 Uと共に、iNOS(26)を誘導する。

48時間の刺激の後、細胞はMOCK感染した、または0.1のMOIでSARS CoVに感染した。24 hpiで、ウイルスを採取し、力を前に述べたように決定した。

iNOSの誘導により、子孫ウイルスの収率が約82%減少し(2.1×107から3.9×106 TCID50)が減少することがわかりました(図。(図4A)。4A).この結果は、IFN-γがVEro細胞におけるSARS CoVの複製サイクルに抗ウイルス効果を有することを示す最近の報告を確認した(10)


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iNOSはSARS CoVの複製サイクルに対して阻害効果を有する。ベロE6細胞は、iNOS阻害剤l-NMMAの有無にかかわらず、IL-1βおよびIFN-γでmock処理または治療した。48時間の後処理で、細胞は0.1のMOIでSARS CoVに感染した。プロゲニーウイルスは24hpiで採取し、TCID50(A)を算出して力素を推定した。亜硝酸濃度は、グリース試薬(B)の使用により決定した。3つの別々の実験の平均値が与えられ、誤差範囲は標準偏差を示します。

NOレベルの測定(図。(図4B)4B) サイトカイン処理により生成された亜硝酸濃度が、50μM SNAPで見られたものとほぼ同じレベルに達したことを実証した。

最も興味深いことに、50 μM SNAPを使用したウイルス複製サイクルの阻害のレベルは、サイトカイン処理と同じレベルで観察されました。NO産生がiNOS誘導に依存していることを確認するために、iNOS阻害剤N-モノメチル-l-アルギニン(l-NMMA)(8,26,27,30)の1mM濃度の細胞をIL-1βおよびIFN-γと共に処理した。 l-NMMAは、NOの生産を著しく阻害し、それによってSARS CoVの複製サイクルを回復させた。しかし、ウイルス価はコントロールのそれよりも30%低かったと述べるべきです。この観察の考えられる説明の1つは、l-NMMAがiNOSを完全に阻害できず、したがっていくつかのNOがまだ産生され、ウイルスを阻害している可能性がある(図。(図44).

我々の結果は、NOがSARS CoVの複製サイクルを特異的に阻害することを示し、おそらく感染の初期段階において、iNOSによるNOの産生が抗ウイルス効果をもたらすことを示唆した。しかし、NOの生産は、有害な効果ではなく抗ウイルス作用を発揮するように調整されるべきである。現在、SARS患者のNOのレベルに関する情報はありません。これまでの研究では、NOがマウスのインフルエンザウイルス肺炎の病因に役割を果たしていることを示している(2, 17)。しかし、この病理学的効果は、肺炎のマウスモデルと関連することが示唆されているが、感染者のNOのピークは臨床症状と関連していなかったからである(23)。したがって、動物モデルにおけるSARS感染時のNOの役割とSARS患者におけるNOのレベルは、将来の研究にとって重要な分野を構成する。

確認

ルイス・マルティネス・ソブリドとアドルフォ・ガルシア=サストル(ニューヨーク州マウントシナイ医学部微生物学科)に感謝します。